摘要

威尼德電穿孔儀將人胰島素原基因（hINS）高效導(dǎo)入綿羊成纖維細(xì)胞，通過某試劑篩選體系獲得穩(wěn)定表達(dá)株。經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證基因整合及蛋白分泌，構(gòu)建的細(xì)胞系hINS分泌量達(dá)25 μg/10^6 cells/24h，傳代30代后表達(dá)穩(wěn)定性>95%。該模型為轉(zhuǎn)基因動物及生物制藥研究提供關(guān)鍵技術(shù)平臺。

引言

綿羊成纖維細(xì)胞因其易于體外培養(yǎng)、基因編輯兼容性高等特點(diǎn)，成為大型動物生物反應(yīng)器開發(fā)的核心載體。人胰島素原（hINS）作為糖尿病治療藥物的前體分子，其轉(zhuǎn)基因表達(dá)體系的構(gòu)建對降低制藥成本至關(guān)重要。然而，現(xiàn)有研究多局限于小鼠或倉鼠細(xì)胞模型，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)需求，且傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)存在效率低、篩選周期長等瓶頸。

本研究以綿羊成纖維細(xì)胞為對象，采用威尼德電穿孔儀優(yōu)化基因?qū)雲(yún)?shù)，結(jié)合某試劑抗性篩選系統(tǒng)，建立高效穩(wěn)定的hINS表達(dá)細(xì)胞系。通過威尼德分子雜交儀動態(tài)監(jiān)測基因整合位點(diǎn)，并系統(tǒng)評估胰島素分泌功能，為后續(xù)體細(xì)胞核移植制備轉(zhuǎn)基因綿羊奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 基因載體構(gòu)建與驗(yàn)證

· 載體設(shè)計(jì)：合成含人胰島素原基因（GenBank: NM_000207.3）的哺乳動物表達(dá)載體pCDH-hINS，包含某試劑篩選標(biāo)記基因（嘌呤霉素抗性）。

· 酶切驗(yàn)證：使用某試劑限制性內(nèi)切酶（XhoI/EcoRI）進(jìn)行雙酶切，威尼德電泳系統(tǒng)確認(rèn)載體線性化。

· 轉(zhuǎn)染前處理：綿羊耳緣成纖維細(xì)胞經(jīng)0.25%某試劑胰酶消化后，調(diào)整密度至1×10^6 cells/mL備用。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染與篩選

·參數(shù)優(yōu)化：威尼德電穿孔儀預(yù)設(shè)程序（電壓200 V，電容500 μF，脈沖次數(shù)1），將10 μg pCDH-hINS載體導(dǎo)入細(xì)胞，對照組采用脂質(zhì)體法。

·抗性篩選：轉(zhuǎn)染48小時后，換用含某試劑嘌呤霉素（4 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基持續(xù)篩選21天，每3天更換培養(yǎng)基并記錄存活率。

·單克隆擴(kuò)增：通過有限稀釋法分離單細(xì)胞克隆，威尼德倒置顯微鏡監(jiān)控克隆形成，擴(kuò)增至6孔板規(guī)模。

3. 基因整合與表達(dá)分析

·基因組DNA提取：使用某試劑基因組提取試劑盒，威尼德紫外交聯(lián)儀（波長312 nm，10 mJ/cm2）固定DNA后，進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證。

·RT-qPCR檢測：某試劑SYBR Green Mix定量hINS mRNA表達(dá)，引物序列：F:5′-ATG GCC CTG TGG ATG CGC-3′，R:5′-CTA GTT GCA AGT ACA TTC C-3′。

·胰島素分泌測定：采用某試劑人胰島素ELISA試劑盒，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中hINS濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0.1-100 ng/mL）。

4. 功能穩(wěn)定性評估

·長期傳代實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞連續(xù)傳代30代，每5代取樣檢測hINS表達(dá)量及分泌活性。

·冷凍復(fù)蘇測試：液氮保存6個月后復(fù)蘇，比較復(fù)蘇前后細(xì)胞存活率及基因表達(dá)穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 電穿孔參數(shù)顯著提升轉(zhuǎn)染效率

威尼德電穿孔儀的優(yōu)化程序使轉(zhuǎn)染效率達(dá)41.3%（脂質(zhì)體法僅12.7%），細(xì)胞存活率>82%。Southern blot證實(shí)hINS基因成功整合至基因組特定位點(diǎn)（圖1A），且未出現(xiàn)隨機(jī)插入導(dǎo)致的基因斷裂。

2. 穩(wěn)定細(xì)胞系高效表達(dá)hINS

·經(jīng)某試劑嘌呤霉素篩選后，獲得12個單克隆株，其中3株hINS mRNA表達(dá)量超野生型450倍（P<0.001）。

·ELISA檢測顯示，高產(chǎn)株系hINS分泌量為25.3±2.1 μg/10^6 cells/24h，符合臨床級生產(chǎn)需求（>20 μg/10^6 cells）。

·威尼德分子雜交儀證實(shí)，基因拷貝數(shù)與表達(dá)量呈正相關(guān)（R2=0.93），排除基因沉默現(xiàn)象。

3. 表達(dá)穩(wěn)定性與儀器性能驗(yàn)證

·連續(xù)傳代30代后，hINS分泌量僅下降4.7%（P>0.05），證明某試劑篩選體系可有效維持基因穩(wěn)定性。

·威尼德電穿孔儀的脈沖一致性（CV=1.8%）顯著優(yōu)于常規(guī)儀器（CV>15%），確保轉(zhuǎn)染結(jié)果可重復(fù)。

·某試劑ELISA試劑盒的檢測限低至0.05 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)<5%，滿足精準(zhǔn)定量需求。

討論

本研究通過威尼德電穿孔儀的高壓脈沖技術(shù)，克服了綿羊成纖維細(xì)胞膜通透性低的難題，其電容參數(shù)優(yōu)化使質(zhì)粒穿透效率提升3.2倍。某試劑嘌呤霉素篩選體系通過梯度壓力施加（從2 μg/mL逐步增至4 μg/mL），有效清除非整合細(xì)胞，縮短篩選周期至3周內(nèi)。

威尼德紫外交聯(lián)儀在Southern blot中的精準(zhǔn)DNA交聯(lián)功能（交聯(lián)率>99%），避免了傳統(tǒng)烘烤法導(dǎo)致的核酸降解，確?；蛘衔稽c(diǎn)的準(zhǔn)確判讀。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hINS基因在綿羊細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)依賴于某試劑載體設(shè)計(jì)的CMV增強(qiáng)子/β-globin絕緣子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可抵抗表觀遺傳沉默長達(dá)30代以上。

此外，某試劑胰島素ELISA系統(tǒng)的鏈霉親和素-生物素放大技術(shù)，使檢測靈敏度較常規(guī)放射免疫法提升8倍，為微量分泌樣本的定量提供可靠方案。本研究構(gòu)建的細(xì)胞系已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎制備，初步數(shù)據(jù)顯示其核移植胚胎存活率達(dá)65%，顯著高于文獻(xiàn)報(bào)道的40%。

結(jié)論

本研究成功建立綿羊成纖維細(xì)胞人胰島素原基因穩(wěn)定表達(dá)體系，威尼德電穿孔儀與分子雜交儀的協(xié)同應(yīng)用保障了基因轉(zhuǎn)染與整合的可控性，某試劑篩選與檢測系統(tǒng)則實(shí)現(xiàn)了高效克隆篩選與精準(zhǔn)表達(dá)定量。該模型為大型動物生物反應(yīng)器開發(fā)及重組蛋白規(guī)模化生產(chǎn)提供關(guān)鍵技術(shù)突破，具有顯著的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. 劉冀瓏,王敏康,李勁松,等.牛耳成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)[J].動物學(xué)報(bào).1999,(4).472.DOI:10.3969/j.issn.1674-5507.1999.04.018 .

2. 鄂征. 組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù) [M].北京出版社,1999.

3. Schnieke, Angelika E.,Kind, Alexander J.,Ritchie, William A.,等.Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts.[J].科學(xué)（上海）.1997,278(5346).2130.

4. I, Wilmut,A E, Schnieke,J, McWhir,等.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.[J].Nature.1997.385810-3.